1樓:匿名使用者
有點波動可能是由於儀器精密度引起的,不必太在意
老師,您好,有些問題想諮詢您,我不太明白實時熒光定量pcr溶解曲線的tm值是儀器自動給出的嗎,
2樓:有能註冊的名嗎
較好的溶解曲線應該只有目的片段單一的峰,如果在目的片段靠前的位置有小峰,可能是引物二聚體汙染,為什麼你的曲線什麼峰都沒有呢?
定量pcr熔解曲線為何不止一個主峰?
3樓:匿名使用者
博凌科為-為你解bai答:
du1.引物設計不夠優化zhi。應避免引物二dao聚體和髮夾結構的出現版。2.
引物濃度不佳。適當權降低引物的濃度,並注意上下游引物的濃度配比。3.
鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix試劑盒。4.
模板有基因組的汙染。rna提取過程中避免dna的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。
4樓:匿名使用者
最主要的原因:
1.有非特異性產物
2. 有引物2聚體。
建議你重新設計引物。而且目前sybr green的方法已經逐漸被淘汰了,最好改用probe-primer 的方法來做。
實時定量pcr的繪製溶解曲線應該從多少度開始升溫
5樓:匿名使用者
如果擴增產物只有目標序列的話就應該只有一個峰的。
1.簡單的說來,溶解曲線就是在採用熒光染料法進行實時定量pcr時採用的一種分析手段。當體系的溫度逐漸升高的時候,體系中的pcr產物慢慢的由雙鏈變成單鏈,這是一個逐漸變化的過程。
由於熒光染料能插入到雙鏈dna中而發光,單鏈不發光,因此可以看到熒光的變化。在實時熒光pcr儀中都應該自帶分析軟體,看溶解曲線主要是看其峰在什麼位置,不同的核酸會有不同的峰。同一核酸的峰差別應該不大,一般能控制在正負0.
5度內。
2.溶解曲線是做染料法定量pcr時,用到的一種結果分析方法。
一般染料法定量pcr在進行完pcr後都要執行熔解曲線,一般設定先94度幾分鐘,然後驟冷到65度(假定65度為退夥溫度)。在65度時,pcr產物是以雙鏈的形式存在的,因為染料是插到雙鏈dna的小溝裡然後發熒光的,所以這個時候檢測到很強的光訊號,隨著溫度升高,雙鏈逐漸開啟,熒光訊號逐漸減弱。因為理論上要檢測的樣本長度一定,所以到達某一個溫度的時候,應該全部解鏈,我們假設在88 度的時候pcr產物全部解鏈,這個時候就是我們在熔解曲線圖上看到的所有曲線同時驟然下滑的那個點,一般把最高溫設定在94度左右。
如果下滑點不在一個溫度,說明不是一種產物。
6樓:匿名使用者
一般都是50到90度
55度有小峰的話很可能就是非特異擴增出的雜帶,把pcr產物拿去電泳,如果是非特異條帶的話,適當提高退火溫度,提高2度左右,再不行就縮短退火和延伸時間
7樓:士誠小人也
一般是從65度開始,升到90度左右
8樓:滑茗緒惜兒
實時pcr產物的tm值大小一般會在80°上下,所以溶解曲線不必從40°開始,可以從65°開始進行溶解曲線繪製,另外在產物之前出現的小峰,同時也在陰性對照中出現了,應該是引物二聚體或者是非特異的擴增。
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