1樓：韓小霞
一般來說，一bai段基因序列經過克du
隆後，克隆zhi到載體中進行測序dao。在兩個層次上發內生變化。首先在
容pcr擴增的過程中可以產生錯誤。將片段插入到載體中也可能發生突變.其次測序準確率的問題。
abi公公司承諾其儀器的測序準確度在一定範圍內可以達到98.5%以上。由於準確率的限制，在一個較長的序列中發生鹼基序列錯誤時難以避免的，在確認克隆準確無誤的情況下，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。
您如果想得到最準確的序列，進行雙向測序時必要的。只進行單項測序，無法保證序列的完全準確性，這是由儀器的精確度決定的.
至於終止密碼子是否在測序上的看您的終止子是否在這一片段上即終止子位置.假若不再這一段序列當然不能找到.
2樓：匿名使用者
測序結果不一致，這個直接諮詢給你測序的公司就行了。如果測序結果可信度高，這個相似性就太低了。
測序完成後是否有終止密碼子就要看你測序的這一段是否包含了終止密碼子了，這個需要你自己分析。
構建質粒表達載體為什麼要先連t載再連pmv261?
3樓：
先連線t載體是為了提高轉化效率
一般來說市面上**的t載體都進行了優化，容易連線片段（也就是效率較高），因此構建表達載體時有時會先連線t載體。同時t載體的測序引物比較明確（商業化的緣故），因此測序也方便一些。更重要的是，t載體往往設計了藍白斑篩選的功能，插入片段的載體會呈現白色，這樣也容易區分驗證，不用每個單菌落都拿去做colony pcr或提質粒酶切驗證。
當然也不是絕對的，我們實驗室就經常直接把片段酶切後連線表達載體，不經過t載體這一步，其實影響並不大。如果你的情況比較特殊（比如片段較大，或是對應的表達載體拷貝數較低等），可以考慮連線t載體，不然的話不是非常必要。
t 載體與 目的基因連線成功，測序結果也正確。從新搖菌，提取質粒，在進行雙酶切，一直切不下來。
4樓：匿名使用者
解決辦法：bai1、cla1是一個比較不常見的酶，du可能酶切體系和
zhiecor1的緩衝dao體系不一樣，試著分別回酶切，就是先切cla1，然答後純化後切ecor1；或者查詢哪個酶的酶切效率高些，那個後切；2、3個小時可能太短了，我一般都是5個小時，或者過夜；3、可能是你菌挑錯了，或汙染了，重新調菌或者把原來構建成功的質粒進行轉化，再酶切。希望對你有幫助。
5樓：郭海強
可能是你酶的問題哦，加入酶失活了，切一個星期都沒用，建議換另外實驗室的試一下。
6樓：匿名使用者
你的引物含有claⅰ的酶切位點嗎？用載體上的其他酶切位點，雙酶切鑑定下看看。也許酶有問題
如何將目的基因連線到t載體進行測序
7樓：匿名使用者
如何將目的基因連來
接到t載體進行源測序
解決辦法：1、cla1是一個比較不常見的酶,可能酶切體系和ecor1的緩衝體系不一樣,試著分別酶切,就是先切cla1,然後純化後切ecor1；或者查詢哪個酶的酶切效率高些,那個後切；2、3個小時可能太短了,我一般都是5個小時,或者過夜；3、可能是你菌挑錯了,或汙染了,重新調菌或者把原來構建成功的質粒進行轉化,再酶切.
用plko.1構建的sh質粒為什麼測序結果和引物不一致
8樓：
先連線t載體是為了提高轉化
效率一般來說市面上**的t載體都進行了優化，容易連線片段（也就是效率較高），因此構建表達載體時有時會先連線t載體。同時t載體的測序引物比較明確（商業化的緣故），因此測序也方便一些。更重要的是，t載體往往設計了藍白斑篩選的功能，插入片段的載體會呈現白色，這樣也容易區分驗證，不用每個單菌落都拿去做colony pcr或提質粒酶切驗證。
當然也不是絕對的，我們實驗室就經常直接把片段酶切後連線表達載體，不經過t載體這一步，其實影響並不大。如果你的情況比較特殊（比如片段較大，或是對應的表達載體拷貝數較低等），可以考慮連線t載體，不然的話不是非常必要。
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