1樓：匿名使用者
你拿著dnaman玩兩天，就什麼都會了，這個東西不當面教你，會費很多筆墨，大家都是自己拿著軟體鼓搗出來的，多練練吧。
2樓：匿名使用者
用primer5和oligo6秒殺它。。dnaman什麼的玩玩就會了。原則都一樣，需要的話可以追加提問
3樓：匿名使用者
已發郵箱~~~ 希望對你有幫助
pcr引物設計應遵循哪些原則
4樓：北京索萊寶科技****
pcr引物設計的11條**法則
1.引物最好在模板cdna的保守區內設計。 dna序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。
在ncbi上搜尋不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如dnaman）比對（alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
2.引物長度一般在15~30鹼基之間。 引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於taqdna聚合酶進行反應。
3.引物gc含量在40%~60%之間，tm值最好接近72℃。 gc含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。
上下游引物的gc含量不能相差太大。另外，上下游引物的tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於tm值5~10℃。
若按公式tm=4（g+c）+2（a+t）估計引物的tm值，則有效引物的tm為55~80℃，其tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
4.引物3′端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增的特異性與效率。
5.引物3′端不能選擇a，最好選擇t。 引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為a時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為t時，錯配的引發效率大大降低，g、c錯配的引發效率介於a、t之間，所以3′端最好選擇t。
6.鹼基要隨機分佈。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的列，否則容易導致錯誤引發（falsepriming）。
降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分佈最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在gc富集序列區錯誤引發。
7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾結構（hairpin）使引物本身復性。
這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（dimer與crossdimer）的形成。
引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應儘量使其△g值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。
否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使pcr反應不能正常進行。
8.引物5′端和中間△g值應該相對較高，而3′端△g值較低。 △g值是指dna雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△g值越大，則雙鏈越穩定。
應當選用5′端和中間△g值相對較高，而3′端△g值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△g值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發dna聚合反應。（不同位置的△g值可以用oligo6軟體進行分析）
9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′端決定著pcr產物的長度，它對擴增特異性影響不大。
因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質結合dna序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。
10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。
用有關軟體（比如rnastructure）可以**估計mrna的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g°）小於58.6lkj/mol時，擴增往往不能成功。
若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧gtp取代dgtp對擴增的成功是有幫助的。
11.引物應具有特異性。 引物設計完成以後，應對其進行blast檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
5樓：匿名使用者
長度18-25bp，沒有錯配，3』端不是a，gc含量在40到60%
6樓：匿名使用者
1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大於38bp；
2、引物gc含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物gc含量和tm值要保持接近；
3、引物所對應的模板序列的tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合；
4、δg值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的δg值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利於正確引發反應，3'末端雙鏈的δg值在0--2kcal/mol時，pcr產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少於20%，-10時接近於0；
5、錯配率一般不要超過100，否則會出現非目的條帶。但對於某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為340以上，而在錯誤位點的引發效率為110，並且不好找到其他更合適的引物，那麼這對引物是可以接受的；
6、frq曲線為oligo6軟體新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重複機率大小，選取引物時，應該用frq值相對較低的片段；
7、引物二聚體及髮卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致pcr不能正常發生；
8、3'端最好不要是連續鹼基，ggg或ccc會導致錯誤的引發，同時3'端最後一個鹼基最好不要是a或t，若是，會導致錯配；
9、以公式tm=4*（g+c）+2*（a+t）-5計算tm值，也就是退火溫度。選擇較低tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的tm值相匹配，且在70-75℃範圍內；
10、模板與穩定性較小的引物之間的tm的差異越小，pcr的效率越高。因為解鏈溫度也取決於它的長度，如果期待的產物長度等於或小於500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產物長5kb，則用24bp的引物；
11、在dna測序和pcr中最好用5'末端穩定（gc含量多），而3'端不穩定（at含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應；
12、引物和產物之間的tm值相差別太大，20攝氏度範圍內最好。
13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據需要新增保護鹼基。
引物設計原則
7樓：匿名使用者
引物設計有 3 條基本原則：
引物與模板的序列要緊密互補。
引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。
再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應(即錯配)。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條dna模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條dna模板鏈互補。
在pcr（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用pcr擴增技術，目的基因dna受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在dna聚合酶作用下進行延伸，如此重複迴圈，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。
pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。如前述，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保pcr的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應(即錯配)。具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列 tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆g 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及髮夾結構（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的gc 含量（composition），等等。
必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。
做real time時,用於sybr green i法時的一對引物與一般pcr的引物,在引物設計上所要求的引數是不同的。引物設計的要求：
避免重複鹼基，尤其是g。
tm=58-60度。
gc=30-80%。
3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的g或c。
正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
pcr擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
引物的退火溫度要高，一般要在60度以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組dna汙染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組dna汙染的影響。
做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做汙染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。
關於blast的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在genebank中公開的全部物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。
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