1樓：竹長菁淦縈
熔解溫度（tm）是引物的一個重要引數。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈dna分子時的溫度.tm對於設定pcr退火溫度是必需的。
在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，
同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的
tm低5℃。
設定tm有幾種公式。有的是**於高鹽溶液中的雜交，適用於小於18鹼基的引物。
有的是根據gc含量估算tm。確定引物tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性**引物的雜交穩定性。大部分計算機程式使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。
開始低於估算的tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的tm值。引物對的tm差異如果超過5℃，就會引物在迴圈中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物tm不同，將退火溫度設定為比最低的tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高tm設計的退火溫度先進行5個迴圈，然後在根據較低tm設計的退火溫度進行剩餘的迴圈。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2樓：壤駟馨欣戈渟
計算退火溫度的方法：
1.退火溫度＝4×（g＋c）＋2×（a＋t）－（5～8）只是粗算，有時不靈，但比較簡便。
2.用primer5（or
oligo6）計算，引物配對好後，primer5可以顯示tm，我認為這個值就是退火溫度，我的經驗再加2
or3度最好。
3.合成引物的單子上也有個tm，減去5～8也可，但有些公司提供的tm就是方法1計算的。
我認為方法二最準確，不知道還有其他方法嗎？
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