1樓:匿名使用者
1. 噬菌
噬菌體(phage)是感染細菌的一類病毒,有的噬菌體基因組較大,加入λ噬菌和t噬菌體等;有的則較小,如m13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應用最為廣泛。
λ噬菌體由頭和尾構成,其基因組是長約49kb的線性雙鏈dna分子,組裝在頭部蛋白質外殼內部,其序列已被全部測出。λ噬菌體感染時,通過尾管將基因組dna注入大腸桿菌,而將其蛋白質外殼留在菌外。dna進入大腸桿菌後以其兩端12bp的互補單鏈粘末端環化成環狀雙鏈,可以兩種不同的方式繁殖:
1溶菌性方式(lytic pathway):在營養充足,條件適合細菌繁殖時,利用宿主菌中的酶類和原料,λdna上基因可按調控的順序表達合成構成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質,λdna經多次複製合成許多子代λdna,於是裝配成許多子代的λ噬菌體,最後裂菌,釋放出許多新的λ噬菌體。2溶原性方式(lysogenic pathway):
進入細菌的λdna可整合(integrate)入細菌的染色質dna中,隨細菌染色體dna複製,傳給細菌後代,這個穩定潛伏在細菌染色質dna中的λdna稱為原噬菌體(prophage),含有原噬菌體的細菌稱為溶源菌(lysogen)。λdna的整合是可逆的,原噬菌體可從宿主dna中切出,進入溶菌性方式的繁殖。
λ噬菌體整個基因組可分為三個部分,1左臂:從a到j長約20kb,其中的基因編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質。2中段:
長約20kb,是λdna整合和切出,溶原生長所需的序列。3右臂:長約10kb,是調控區,控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及λdna複製起始均在這區域內。
左右臂包含λdna複製、噬菌體結構蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列;對溶菌生長來說,中段是非必需的。
利用λ噬菌體作載體,主要是將外來目的dna替代或插入中段序列,使其隨左右臂一起包裝成噬菌體,去感染大腸桿菌,並隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。現在廣泛使用的λ噬菌體載體也是已作過許多人工改造的,主要的改造是:1設計去除λdna上的一些限制性酶切點。
這是因為λdna較大,序列中的限制性酶切點過多,妨礙其應用。2在中段非必需區,替換插入某些標誌基因如上述的可供藍白篩選laci-lacz』序列,和多克隆位點等。由此可構建出兩類λ噬菌體作載體;一類是插入型載體,可將外來序列插中段,常用的λgt系列載體,一般容許插入5-7kb外來dna;另一類是轉換型載體,即可用外來dna替代中段,如imbl系列載體。
插入或置換中段外來的dna長度是有一定限制的,當噬菌體dna長度大於野生型λ噬菌體基因組105%或小於78%時,包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長5-20kb的外來dna,這比質粒載體能插入的dna長得多;而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質粒轉化細菌的效率高得多,所以λ噬菌體載體常用於構建cdna文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質粒載體複雜。
如果將左右臂和中段都去除,僅留下λdna而端包裝噬菌體所必需的cos序列,再加上質粒的複製序列、標誌基因、多克隆位點等,就可構成cos質粒或稱為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源dna,然後用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體,感染大腸桿菌後,粘粒的dna能以質粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用於dna文庫的構建。
2. cos質粒載體
co**id 是英文 cos site-carrying pla**id 的縮寫, 本意是帶有粘性末端位點的質粒, 因此, 柯斯質粒是人工建造的的含有λdna的cos序列和質粒複製子的特殊型別的質粒載體。
柯斯質粒的構建一般都是利用質粒的複製子、選擇標記, 加上λ的cos位點序列及與包裝有關的序列,構建的科斯質粒可以很好地用於基因克隆。
早期構建的科斯質粒載體有一些不足,如克隆位點較少,抗性標記單一,容栽能力不大,後來進行了一些改進,克服了這些不足。
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