RTPCR的引物設計有什麼不同嗎

1樓:匿名使用者

沒有嚴格的要求,只要考慮兩方面就行:(1)擴增的特異性;(2)擴增的高效性。所以總體要求引物不能太長,擴增產物不能太長,其他引數綜合考慮不能太差。

做pcr,rtpcr和做克隆基因的引物有何不同

2樓:匿名使用者

不同點很多。最簡介回答,是目的不同,側重點也不同:

普通pcr。只考慮能不能擴增出來就行。

rtpcr。上熒光的話,對引物質量要求高,得做個hplc或者page純化;其次對引物設計要求高,考慮得率,特異性等因素。

克隆引物。考慮加入常見酶切位點,匯入何種目的載體,鹼基密碼子偏好性等。

3樓:濤濤濤

你做的是什麼實驗呢?引物設計設計範圍很廣

pcr,rt-pcr,實時熒光定量pcr的區別與聯絡

4樓:永恆的瞬間綻放

1、所說的pcr應該就是最常規的pcr,以dna為模板,通過上下游引物,實現dna的擴增。

2、rt-pcr一般情況下是指反轉錄pcr(reverse transcription),儘管有些資料上說實時熒光定量pcr也(realtime fluores-cence quantitative pcr)也簡稱rt-pcr,但是這是不對的,不推薦。

基本操作過程是將所提取的rna進行反轉錄,然後將所獲得的cdna作為模板,設計引物進行擴增,是一種檢測基因表達的常用方法。

3、實時熒光定量pcr也就是real-time pcr,其最大的作用是檢測樣品中的初始dna濃度。

至於三者的關係,rt-pcr和實時定量pcr應該都屬於pcr,在rna實驗中,這二者都會應用到。

例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異,首先你要提取2個組織的總rna,然後通過rt-pcr檢測該基因是否在2個組織中有表達,然後通過實時定量pcr測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。

擴充套件資料:

pcr原理

dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在dna聚合酶的參與下,根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現,dna在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制dna的變性和復性,加入設計引物,dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的體外複製。

但是,dna聚合酶在高溫時會失活,因此,每次迴圈都得加入新的dna聚合酶,不僅操作煩瑣,而且**昂貴,制約了pcr技術的應用和發展。

耐熱dna聚合酶-taq酶的發現對於pcr的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90°C以上的高溫而不失活,不需要每個迴圈加酶,使pcr技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,pcr技術得以大量應用,並逐步應用於臨床。

pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:

1模板dna的變性:模板dna經加熱至93°C左右一定時間後,使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;

2模板dna與引物的退火(復性):模板dna經加熱變性成單鏈後,溫度降至55°C左右,引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合;

3引物的延伸:dna模板-引物結合物在72°C、dna聚合酶(如taqdna聚合酶)的作用下,以dntp為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈,重複迴圈變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,

而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

mirna的rtpcr的後引物或探針是可以通用的嗎

5樓:匿名使用者

可能這得看你的運bai氣了~我du每次反轉錄zhi三四個都沒有問題的~dao 因為大部分的引物序列回都是一樣的~答所以沒事~不會錯配~但是並不排除發生錯配的可能~ 我們就有人反轉錄不出來~u6都出不來~那就分開弄~我沒也就是普通的反轉錄的酶~m-mlv矮ace矮都。