1樓：北戴河的漁
使用抗組蛋白和抗dna的單克隆抗體酶聯免疫分析可以測得細胞凋亡形成的一種特殊複合物－－細胞凋亡時，細胞內dna降解形成的核小體dna可與核心組蛋白質h2a、h2b、h3、h4緊密結合形成的。
此法可定量、定性，但不能定位。
2樓：匿名使用者
一、概述
細胞凋亡（apoptosis,apo）是細胞增殖的反面，**的是細胞死亡的方式與機制。凋亡一詞**於希臘語。原指花瓣、葉片的脫落。
自2023年kerr首次提出細胞凋亡的概念以來，隨著細胞生物學、免疫學和腫瘤學的研究發展，最近幾年人們對細胞凋亡的重大理論意義和實際意義有了更深的理解。細胞凋亡是指在一定的生理和病理情況下，機體為維護內環境的穩定，通過基因調控而使細胞自動消亡的過程。不同型別的細胞，在發生凋亡時的動力學過程也不一致，存在著一定的形態學和生物化學的差異，但若干基本變化是大同小異的。
其特徵為：整個胞體呈濃縮狀，有特異性胞漿大泡，胞質、核質深染，核碎裂後被細胞膜包裹而形成凋亡小體（apoptosis body）。它有別於細胞死亡（necrosis,nec）。
在瓊脂糖凝膠電泳上顯示出特殊的dna梯狀圖譜。它的出現主要是由於一種鈣-鎂依賴性核酸內切酶啟用後，裂解染色質核小體（nucleosome）之間的連線dna，將核小體切割成180bp～200bp或其倍數的片段所致。apo是不可逆的過程，散在分佈於組織中，形成的凋亡小體，除核裂解外，外有膜包繞，內有完整的細胞器，凋亡小體在組織中很快被鄰近組織細胞吞噬，並在溶酶體中被降解。
因此，apo不引起周圍組織炎症及損傷。apo是機體自己啟動，由細胞本身主動控制，由基因指導的細胞自我消亡過程。因此，又稱程式性細胞死亡（programmed cell death,pcd）。
光鏡下，apo的典型形態學特徵是核染色質廣泛凝聚，細胞體積縮小，胞質濃縮，有凋亡小體存在，細胞表面特化結構如微絨毛等丟失及細胞表面明顯的迂曲。體內細胞凋亡過程發展非常迅速，細胞常在數小時內完成apo並降解，凋亡細胞僅出現數分鐘就消失，故不適宜應用形態學方法（普通光學顯微鏡檢測法、熒光顯微鏡檢測法、凋亡小體的電鏡觀察及凋亡指數和細胞活力的定量測定）來檢測。在生物化學方面，利用電泳技術證明核體斷片的「dna梯狀圖譜」作為檢測群體細胞發生凋亡的一個指標。
經過人們多年的研究發現，應用原位末端轉移酶標記技術（tdt assay or tunel reaction）來檢測細胞凋亡，其靈敏度高，特異性強，能早期顯示未發生典型變化的凋亡細胞。它是檢測單個細胞早期出現凋亡現象的好方法。近幾年，人們又發現了能更快、更敏感、檢測細胞數量更多的並能從更多方面證明凋亡和壞死的流式細胞分析術（flow cytometry，fcm 包括亞「g1」峰檢測法和末端轉移酶標記技術）等。
本章僅介紹免疫學檢測方法。
二、elisa法
（一） 原理
細胞凋亡的發生，是由於鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割dna,產生180bp～200bp或其倍數的核小體片段。而核小體由於與組蛋白h2a、h2b、h3和h4形成緊密複合物而不被核酸內切酶切割。採用雙抗體夾心酶免疫法，應用小鼠抗dna和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結構，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。
（二）材料與試劑
1．採用boehringer mannheim公司試劑盒，生物標記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。 2．過氧化物酶（-pod）標記的小鼠抗dna單克隆抗體
3．鏈黴親合素包被的微孔板
4．dna－組蛋白複合物，作為陰性對照。
5．abts底物
6．溶解緩衝液
7．溫育緩衝液
8．底物緩衝液
（三）樣品
1．培養細胞或離體細胞的裂解物 細胞裂解步驟：收集細胞，離心後，用200µl溶細胞緩衝液重新懸浮，室溫下作用30min。
2．培養細胞的上清液
3．血漿（血清）
（四）操作方法
1．取樣品離心後（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入鏈黴親合素包被的培養板孔中。
2．另加入80µl免疫反應試劑 含抗－dna－pod、抗組蛋白－生物素及溫育緩衝液（按1∶1∶18混合），室溫下孵育2h（置搖床上，250r/min）。
3．取上清，用300µl溫育緩衝液洗滌3次，小心移去洗滌液。
4．加入100µl底物緩衝液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。
5．儘快作比色分析（10min～20min內），用底物緩衝液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進行檢測。
（五）結果判定
按下列公式計算細胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：
注：mu=吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均od值－底物od值，若樣品的吸
收值超過比色測定範圍，應適當稀釋後再檢測。
三、原位末端轉移酶標記技術
（一）原理
凋亡細胞是由於內源性核酸內切酶的啟用後，將dna切割成許多雙鏈dn**段以及高分子量dna單鏈斷裂點（缺口），暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核苷酸轉移酶（tdt）將標記的dutp進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。主要應用的是熒游標記法和酶標記法。
（二）熒游標記法
1．材料與試劑 採用德國boehringer-mannheim公司in situ cell death detection 試劑盒，或美國oncor公司apoptagtm試劑盒，包括：
⑴生物素標記的-dutp(biotin-dutp)或地高辛標記的-dutp(digoxingeningll-dutp)1nmol/µl
⑵ tdt酶（25u/μl）
⑶ 反應緩衝液
⑷ 洗滌緩衝液
⑸ 異硫氰酸熒光素（fitc）標記的親合素或鏈黴親合素（2.5µg/ml）或抗地高辛抗體（1∶30）
⑹ pi染液（含pi 5µg/ml及無dna酶活性的rna酶0.1%）
⑺ pbs緩衝液
⑻ 塑料蓋玻片
2.樣品
⑴ 懸浮生長培養細胞的甩片或塗片
⑵ 貼壁生長的培養細胞
⑶ 冰凍切片
⑷ 常規石蠟切片
3.操作方法
（1）固定：培養細胞的製片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)後，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規4%中性****固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。
（2）洗滌：玻片浸入pbs緩衝液，搖床上洗滌5min,三次。
（3）反應：洗滌後的玻片用吸水紙吸幹細胞或組織周圍水分，按50μl/㎝2滴加反應液（每50μl反應液含tdt酶0.5μl,標記的-dutp 1μl）,使反應液均勻地覆蓋於所有細胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置溼盒中,37℃孵育1h。
（4）終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩衝液的染色缸內，洗滌兩次，每次5min。
（5）fitc標記：洗滌後的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/㎝2滴加fitc反應液（含fitc 2.5μg/ml），室溫下避光孵育10min。
（6）洗滌：將玻片置於洗滌緩衝液內，洗兩次，每次5min。
（7）pi復染：將玻片置於盛有pi染液的染色缸內，室溫下避光染色30min。
（8）封片：用蓋玻片直接蓋在含pi染液的玻片上，亦可用無色指甲油塗於蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，儘早鏡檢觀察。
4.結果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發光（波長488nm），所有的細
胞核均被pi著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上fitc，顯示出黃綠色熒光。
(三)酶標記法
1.材料與試劑 採用美國oncor公司apoptagtm-peroxidase試劑盒，包括：
⑴ 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體
⑵ 反應緩衝液
⑶ tdt酶
⑷ 反應終止/洗滌液
⑸ 平衡緩衝液
⑹ 蛋白酶k消化液：20μg/ml蛋白酶k溶於pbs。
⑺ 30% h2o2
⑻ dab顯色液：0.05%的diaminobenzidine(dab)溶於pbs，用前過濾並加入
0.02% h2o2。
⑼ 甲基綠染液：0.5%甲基綠溶於0.1mol/l枸櫞酸鈉，ph調整到4.0。
⑽ 塑料蓋玻片及玻璃蓋玻片
2．樣品 同熒游標記法。
3．操作方法
⑴ 固定：同熒游標記法。
⑵ 內源性過氧化物封閉 玻片置於盛有0.5% h2o2緩衝溶液的染色缸內，室溫下作用20min後，同熒游標記法洗滌。
⑶ 消化：玻片浸於盛有蛋白酶k消化液的染色缸，室溫下消化15min，洗滌
同上。⑷ 平衡處理：將細胞或組織周圍液體用吸水紙吸乾，滴加平衡緩衝液（按70µl／cm2）覆蓋細胞或組織表面，蓋上塑料蓋玻片，室溫下作用5min～10min。
⑸ 反應：移去蓋玻片，傾去平衡液，用吸水紙吸乾周圍液體，滴加反應液（按50µl/㎝2，18μl tdt酶+36μl反應緩衝液），均勻覆蓋在細胞或組織上，蓋上塑料蓋玻片，置於溼盒中，37℃溫育1h。
⑹ 終止反應：移去蓋玻片，將玻片置於盛有終止/洗滌液的染色缸內，37℃下洗滌30min（置搖床上振搖）。然後將玻片置於洗滌緩衝液內，洗兩次，每次5min。
⑺ 地高辛抗體反應：用吸水紙吸幹細胞或組織周圍液體，滴加70μl過氧化物酶標記的地高辛抗體，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下置於溼盒中，孵育30min。
⑻ 洗滌：置於洗滌緩衝液內，洗兩次，每次5min。
⑼ 用吸水紙吸幹細胞或組織周圍液體，滴加新鮮配製的dab顯色液，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下作用3min～6min。
⑽ 洗滌：置於蒸餾水中洗滌3次，每次3min～6min。
⑾ 套染：將玻片置於盛有甲基綠染液的染色缸中，室溫染色10min。
⑿ 洗滌：蒸餾水洗滌3次（置於搖床上），每次2min。
⒀ 脫水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。
明膠甘油封片。
4．結果判定 光學顯微鏡下觀察，所有的細胞核均著綠色，凋亡的細胞核染
色質顯示出特異性的棕黃色。
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