做穩定轉染的篩選,為何綠色熒光細胞總是在沒轉染成功的細胞附近

1樓：匿名使用者

博凌科bai為解答：g418加壓後活下來的細du胞都是轉染

zhi成功的。不表達綠dao色熒光的

細胞不回代表沒有轉染答成功，該細胞只表達新黴素磷酸轉移酶基因，因而對g418產生抗性，只是該細胞不表達目的基因。分離只表達目的基因的細胞最好用96孔板用有限稀釋法來獲得單克隆。細胞培養板在鋪細胞前最好先鋪一些滋養細胞。

滋養細胞來制小鼠腹腔。殺死一隻小鼠，用70%酒精消毒，然後開啟腹腔，用20ml培養基清洗腹腔，然後把腹腔清洗液取出鋪板，一隻小鼠腹腔清洗液能夠鋪2－3塊96孔板。第二天再鋪穩定轉染的細胞，一個孔最好鋪2－3個細胞。

長出單克隆的細胞再擴大轉代培養。

穩定轉染之後細胞熒光強度差異很大怎麼辦？

2樓：匿名使用者

理論和抄實際有差別是正常的。也許是受bai表達蛋白和gfp等熒光蛋白之間的相du互影zhi響，有時候，熒光強的dao細胞，你的目的基因的表達並不見的高，反而一些有熒光但熒光強度不高的目的基因的表達較高。你可以通過western blot去驗證。

另外，穩定克隆也不是能使用下去，即使你一直使用篩選藥物，如g418，因為隨著傳代的增多，會有丟失導致表達量下降，因此，穩定克隆在傳6-7代以後或許就應該重新篩選。

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如何構建穩定細胞株？

3樓：心無所依

構建方法：先把質粒整合到染色體上後，用相應的質粒dna中的抗性標誌來篩選該細胞系，就行成了穩定表達的細胞株。

細胞株是用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標誌必須在整個培養期間始終存在。原代培養物經首次傳代成功後即為細胞系(cell line)，由原先存在於原代培養物中的細胞世系所組成。

如果不能繼續傳代，或傳代次數有限，可稱為有限細胞系(finite cell line)，如可以連續培養，則稱為連續細胞系(continuous cell line)，培養50代以上並無限培養下去。

細胞株是通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標誌的培養細胞。從培養代數來講，可培養到40-50代。細胞株的特殊性質或標誌必須在整個培養期間始終存在。

對於人類腫瘤細胞，在體外培養半年以上，生長穩定，並連續傳代的即可稱為連續性株或系。

4樓：匿名使用者

一種是脂質體轉染後，單克隆篩選穩定細胞株。另外一種是應用逆轉錄病毒，慢病毒轉染，篩選穩定細胞株。

脂質體轉染：在轉染24小時後，消化細胞並計數。將細胞種到96孔板，保證每個孔2-3個細胞，這樣才能得到單克隆。

待細胞貼壁後，加入抗生素篩選。篩選時間和濃度視細胞而定。一般g418一個星期作用，嘌呤黴素2-3天。

脂質體法篩單克隆時間較長，且效率低，大概只有1%。

病毒轉染：先要用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，再用病毒轉染目的細胞。包裝病毒視不同型別的病毒而定，一般要3-5天的時間。

包裝好的病毒要測滴度，根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株。

病毒轉染得到穩定細胞株的效率高，只是步驟繁瑣。

現在很多家公司提供構建穩定細胞株的技術服務，如杭州的波因、南京的凱基等，可以提供各種載體的構建及細胞株的構建整套技術服務。

轉染後，熒光消失快，g418不能維持熒光表達，怎麼篩選穩定細胞系

5樓：蒾藥

瞬時轉染是指外源基因

進入受體細胞後，存在於遊離的載體上，不整合到細胞的染色體上，結果是短暫的高水平表達，可在外源基因匯入細胞24～96h內檢測表達效果，表達水平與位置無關，不會受到周圍染色體元件的影響。超螺旋質粒轉染更傾向於瞬時表達。

對於瞬時轉染的檢測：如果有報告基因，就通過報告基因的表達看轉染成功與否；沒有報告基因的話，就在24～96h內收穫細胞通過rt-pcr和wb來鑑定。