免疫熒光如何做定量分析,求助免疫熒光的結果分析

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和免疫組抄化一樣,只能通過軟體分析得出一個「數值」,可以當一個「半定量」的指標,但我認為準確性差,如果是要分析蛋白的表達情況,建議用western比較好些。統計熒光強度的軟體沒有用過,以前只用過免疫組化的光密度分析軟體,影響結果的因素太多了。。。。。

求助免疫熒光的結果分析

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可以用image-pro plus分析灰度

如何做細菌的免疫熒光

3樓:匿名使用者

細胞培養,方法見國家藥典。但是細胞培養耗時更長。

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最好將載玻片先用多聚賴氨酸處理一下,這樣菌容易留在玻片上。若這種蛋白是跨膜蛋白,則最好加上通透劑。

如何做好免疫熒光

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免疫熒光是標記免疫技術發展最早的一種,它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術,通過將抗體與一些示蹤物質結合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光步驟包括,細胞固定和通透,封閉,孵育一抗,二抗等。除了這些基本步驟,以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。

1、細胞固定和通透

為達到最佳的檢測效果,細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵,細胞和抗原需要保證最佳的結構,並利於抗體與抗原結合。通常情況下,需要通過以下步驟得以實現:

細胞用2%-4%多聚甲醛固定,之後用0.1%皁角苷或0.02%的triton x-100進行通透。

前者是比較溫柔的處理,但是對於核內抗原可能無效,需要用到triton。使用皁角苷進行通透時,要注意它會引起細胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外,細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透,可以避免去垢劑的使用。

2、抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的**作為陰性對照,有利於減少降低背景干擾。

3、合適的抗體稀釋比例

通過優化抗體稀釋比例來優化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。

但在能保證低背景染色的前提下,可以通過增加濃度來提高訊號強度。如果是第一次使用該抗體或測定某抗原,強烈建議濃度梯度實驗。

4、優化緩衝液和封閉劑

儘管很多抗原在常見的buffer如pbs中可以很好的被染色,但是對於某些目的抗原,更換一下含有不同離子的緩衝液,比如鈣、鎂、鉀等,可以帶來很大程度上的改善。rockland可提供優化過的ihc用封閉緩衝液,同樣適用於熒光染色實驗。

5、選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實驗,我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗;如果是雙重甚至是多重染色,那麼必須使用預吸附的二抗。同時,請優先選擇來自同一物種的二抗。

6、使用合適的細胞密度

選擇合適的細胞數量進行染色,當細胞數量過多時,細胞結構不好,導致染色背景深,低細胞密度,會使細胞貼壁不佳,狀態不好。

7、多重染色

對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時,可以用各自的抗體進行同時染色,但要求兩個一抗的種屬**不同,標記物不同,而二抗的種屬**需保持一致。

8、降低背景

高背景是免疫熒光常見的問題,解決此問題可以用二抗**的正常血清代替bsa做封閉液,降低抗體濃度,增加洗滌次數,洗滌至少三次,每次五分鐘,推薦洗滌液為pbs+0.05%tween。

9、封片

作為免疫熒光的最後一步,可以提高折射率,保護樣品。

10、資料分析

觀察整體樣片時,選擇具有代表性的細胞進行資料獲取與分析。