1樓:匿名使用者
一般是一個lane跑一個庫比較好吧,也可以通過給不同的庫做好不同標記放在一個lane裡面測啊,不過那都是一些公司節省成本的方法啊,樣本如果資訊太複雜這樣做會出問題的
illumina測序技術術語 lane和run是什麼意思
2樓:匿名使用者
illumina的測序儀是以flowcell進行測序的,一般的一張flowcell是一個run,像hiseq2500的話是2張flowcell,也就是一次執行專的測序量屬。每張flowcell上通常都有多個通道,每個通道可以單獨測不同的樣品,這樣的通道就是lane。hiseq2500的一張flowcell有8條通道,也就是8個lane。
如果上機前使用cbot的話可以每條lane都跑不同的樣品,互不干擾,如果直接上機進行快速模式的話就無法區分不同樣本了。
第二代dna測序技術的操作流程
3樓:咪浠w眯兮
操作流程如下:
1、測序文庫的構建
首先準備基因組,然後將dna隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段,並在兩頭加上特定的接頭。如果是轉錄組測序,則文庫的構建要相對麻煩些,rn**段化之後需反轉成cdna,然後加上接頭,或者先將rna反轉成cdna,然後再片段化並加上接頭。
2、錨定橋接
solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行,flow cell又被細分成8個lane,每個lane的內表面有無數的被固定的單連結頭。上述步驟得到的帶接頭的dna 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供後續的預擴增使用。
3、預擴增
新增未標記的dntp 和普通taq 酶進行固相橋式pcr 擴增,單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性,釋放出互補的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過不斷迴圈,將會在flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分佈的雙鏈待測片段。
4、單鹼基延伸測序
在測序的flow cell中加入四種熒游標記的dntp 、dna聚合酶以及接頭引物進行擴增,在每一個測序簇延伸互補鏈時,每加入一個被熒游標記的dntp就能釋放出相對應的熒光,測序儀通過捕獲熒光訊號,並通過計算機軟體將光訊號轉化為測序峰,從而獲得待測片段的序列資訊。
5、資料分析
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分,但是隻有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始資料是長度只有幾十個鹼基的序列,要通過生物資訊學工具將這些短的序列組裝成長的contigs甚至是整個基因組的框架,或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,並進一步分析得到有生物學意義的結果。
illumina/solexa genome analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在sanger等測序方法的基礎上,通過技術創新,用不同顏色的熒游標記四種不同的dntp,當dna聚合酶合成互補鏈時,每新增一種dntp就會釋放出不同的熒光,根據捕捉的熒光訊號並經過特定的計算機軟體處理,從而獲得待測dna的序列資訊。
4樓:kyoya六
1)測序文庫的構建(library construction)
首先準備基因組(雖然測序公司要求樣品量要達到200ng,但是gnome analyzer系統所需的樣品量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中),然後將dna隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段,並在兩頭加上特定的接頭(adaptor)。如果是轉錄組測序,則文庫的構建要相對麻煩些,rn**段化之後需反轉成cdna,然後加上接頭,或者先將rna反轉成cdna,然後再片段化並加上接頭。片段的大小(insert size)對於後面的資料分析有影響,可根據需要來選擇。
對於基因組測序來說,通常會選擇幾種不同的insert size,以便在組裝(assembly)的時候獲得更多的資訊。
2)錨定橋接(su***ce attachment and bridge amplification)
solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行,flow cell又被細分成8個lane,每個lane的內表面有無數的被固定的單連結頭。上述步驟得到的帶接頭的dna 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供後續的預擴增使用。
3)預擴增(denaturation and ***plete amplification)
新增未標記的dntp 和普通taq 酶進行固相橋式pcr 擴增,單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性,釋放出互補的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過不斷迴圈,將會在flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分佈的雙鏈待測片段。
4)單鹼基延伸測序(single base extension and sequencing)
在測序的flow cell中加入四種熒游標記的dntp 、dna聚合酶以及接頭引物進行擴增,在每一個測序簇延伸互補鏈時,每加入一個被熒游標記的dntp就能釋放出相對應的熒光,測序儀通過捕獲熒光訊號,並通過計算機軟體將光訊號轉化為測序峰,從而獲得待測片段的序列資訊。從熒光訊號獲取待測片段的序列資訊的過程叫做base calling,illumina公司base calling所用的軟體是illumina』s genome analyzer sequencing control software and pipeline analysis software。讀長會受到多個引起訊號衰減的因素所影響,如熒游標記的不完全切割。
隨著讀長的增加,錯誤率也會隨之上升。
5)資料分析(data analyzing)
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分,但是隻有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始資料是長度只有幾十個鹼基的序列,要通過生物資訊學工具將這些短的序列組裝成長的contigs甚至是整個基因組的框架,或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,並進一步分析得到有生物學意義的結果。
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