1樓:舊人舊城丶砘
樣品bai提取總rna後,對於
du真核生物,用帶有
zhioligo(dt)的磁珠富集mrna,對於原核生物dao,用試劑盒去內除rrna,向得到的mrna中加入fragmentation buffer使其容片斷成為短片段,再以片斷後的mrna為模板,用六鹼基隨機引物(random hexamers)合成cdna第一鏈,並加入緩衝液、dntps、rnase h 和dna polymerase i 合成cdna第二鏈,經過qiaquick pcr試劑盒純化並加 eb緩衝液洗脫經末端修復、加鹼基a,加測序接頭,再經瓊脂糖凝膠電泳**目的大小片段,並進行pcr擴增,從而完成整個文庫製備工作,構建好的文庫用illumina hiseq2000進行測序。
rna-seq isoform是什麼意思
2樓:愛是天時地利
中文rna-seq的亞型
rna的測序原理及方法!^~^
3樓:匿名使用者
next generation sequencing就直接測rna,傳統的還是先轉cdna,原因麼應該是rna比較脆弱啦。。。cdna比較穩定。不過弊端還是很多的比方一個很突出的就是3』端bias。。
所以現在有了next generation 的rna seq。原理是一樣的不過就是直接測rna了。
third generation裡邊就開始測single molecule了,像前兩天ibm說的那樣哈哈。。。。。
4樓:冷血殘心
dna和rna的測序方法
dna或rna鹼基序列測定方法,包括步驟:
1)將dna或rna單鏈固定於平面支援物上;
2)將一束鐳射聚焦於一條固定化的單鏈上;
3)通過加入含有(i)用於合成dna互補鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶四種核苷酸的混合物或用於合成rna互補鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶四種核苷酸的混合物和(ii)一種聚合酶的溶液,用來產生上述被固定的、被聚焦的單鏈的dna或rna互補鏈,插入到互補鏈中的每一個被髮游標記物標記了的核苷酸用單分子檢測器進行檢測,以及在下一個被髮游標記物標記的核苷酸插入之前對前一個被髮游標記物標記的核苷酸的發光訊號進行檢測。
5樓:無語翹楚
細胞中的rna可以分為信使rna、轉運rna和核糖體rna三大類,不同組織總rna提取的實質就是將細胞裂解,釋放出rna,並通過不同方式去除蛋白,dna等雜質,最終獲得高純度rna產物的過程。
rna 提取流程
1. 樣品處理
從各種不同**樣品(如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養細胞),或同一**樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質量的rna,因細胞結構及所含的成分不同,樣品預處理的方式也各有差異。
樣品的要求:
最好使用新鮮的樣品或取樣後立即在低溫(-20°C或-70°C)冷凍儲存的樣品,避免反覆凍融,因為這會導致提取的rna降解和提取量下降。
樣品預處理方式:
植物材料-液氮研磨
動物材料-勻漿、液氮研磨
細菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁
2. 細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法(trizol)
這是一種傳統的rna提取方法,適用於大部分動植物材料,但對於次生代謝產物較多的植物材料提取rna效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白複合體解離,並將rna釋放到溶液中,採用酸性酚-氯仿混合液抽提,低ph值的酚將使rna進入水相,而蛋白質和dna仍留在有機相,從而可以完成rna的提取工作。
該法應用非常廣泛,適用於包括動物組織、微生物、培養細胞等在內的各類動物性材料,同時還適用於次生代謝物較少的植物性材料,如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養細胞的rna提取中。
胍鹽/ β- 巰基乙醇法:
適用於各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。
在這種方法中,胍鹽使細胞充**解,β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制rnasea的活性,保護rna不被降解。
我公司的「green 」系列總rna 提取試劑盒是基於這種方法開發的產品,分別適用於各類不同的材料。此係列產品的具體實驗步驟和適用範圍在實驗技術手冊中有詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。
其它方法:
有些植物材料多糖多酚含量較高,如植物果實,番茄的葉子等,有些植物木質化程度較高,如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總rna提取試劑,該試劑特別適合於從富含多糖、多酚、澱粉的材料中提取純度高、完整性好的總rna,有關的具體步驟將在分論中詳細介紹,實驗者可根據自己的需要進行選擇。
3. rna 純化及獲得
純化要求
rna樣品中不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的汙染。排除dna分子的汙染。
純化方法及沉澱
方法一:有機溶劑抽提法
氯仿抽提
在使用rna提取試劑進行rna提取時,常使用氯仿進行抽提,以去除蔗糖、蛋白等雜質,並促進水相與有機相的分離,從而達到純化rna的方法。在本公司的提取rna的產品中,與trizol同型試劑法及其衍生試劑盒。
沉澱氯仿抽提rna後,一般採用了異丙醇或乙醇來沉澱水相rna。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇,室溫沉澱20-30分鐘,高速離心,可獲得rna沉澱。
洗滌沉澱
加入無rnase的75%乙醇,將rna沉澱振盪懸浮,使rna沉澱中的鹽離子被充分溶解。然後再離心10-30分鐘。再次沉澱rna。
離心後,小心倒掉上清(注意不要倒出rna沉澱),隨後快速離心1-2秒,將殘留在管壁上的乙醇手機到管底後,用小槍頭吸淨,超靜臺中風乾1-2分鐘(注意不要晾得太乾,否則rna沉澱不易溶解)。
溶解沉澱
加入適量rnase-free ddh2o溶解rna沉澱。
方法二:矽基質吸附法
隨著實驗方法的改進,現已發展出一種採用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有:矽基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。
矽基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸,使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點,成為核酸純化的首選。
本公司生產的總rna提取試劑盒(zp403-zp407)和greenspin系列總rna提取試劑盒即採用矽基質吸附達到rna分離純化目的,通過專一結合rna的離心吸附柱和獨特的緩衝液系統,使樣品在高鹽條件下與矽膠膜特異結合,而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫,鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌,最後用rnase-free ddh2o將rna從矽膠膜上洗脫下來。
基因表達實驗流程是什麼?
6樓:匿名使用者
1、獲取目的基因
2、目的基因與載體相連
3、含有目的基因的載體匯入宿主細胞(原核或真核)4、轉錄水平的鑑定:提取total rna,可選用realtime-pcr或reverse transcription pcr鑑定
5、蛋白水平鑑定:western blot 等
轉錄組測序和rna-seq的不同是什麼
7樓:愛我家菜菜
轉錄組測序的研究物件為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有rna的總和,主要包括 mrna和非編碼rna 。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發點,通過新一代高通量測序,能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列資訊,已廣泛應用於基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。
8樓:匿名使用者
rna-seq即轉錄組測序技術,就是把mrna,**allrna,and noncoding rna等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來。反映出它們的表達水平。
9樓:翟毅君
轉錄組測序與 rna-seq前期實驗樣本的處理是沒有差別的,主要是測序量的不同及生物資訊側重點的不同,相對來說,轉錄組測序適合於大物種及基因組參考序列相對來說較差的物種,以及無參考基因組的物種,而rna-seq 更適合於參考基因相對明確,一般只想尋找基因表達差異的物種樣本。現在的生物資訊領域rna-seq就是最新的轉錄組測序方法
RNA干擾的RNA干擾回覆實驗，如何構建RNA干擾載體
在rna干擾實驗中 首先需要構建dsrna表達載體 表達產生的dsrna在dicer酶作用下形成sirna引起具有相同序列的mrna發生講解 導致細胞或個體不能合成相應的蛋白質 所以個體會表現出功能缺失表型 構建表達載體通常選用dsrna 需要注意的一些方面是 dsrna序列中gc的含量要小於50 ...
觀察DNA和RNA在細胞中的分佈實驗要保持細胞活性嗎
1 原理與解析 1 真核細胞的dna主要分佈在細胞核內，rna主要分佈在細胞質中。2 甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對dna和rna的親和力不同，甲基綠對dna親和力強，使dna顯現出綠色，而吡羅紅對rna的親和力強，使rna呈現出紅色。用甲基綠 吡羅紅的混合染色劑將細胞染色，可同時顯示dna和rna在細...
簡述信使RNA，轉運RNA和核糖體RNA的結構特點和意義。可
特點 核糖 體rna ribosomal rna，rrna 約佔rna總量的 80 它們與蛋白質結合構成核糖體的骨架。核糖體是蛋白質合成的場所，所以rrna的功能是作為核糖體的重要組成成分參與蛋白質的生物合成。rrna是細胞中含量最多的一類rna，且分子量比較大，代謝都不活躍，種類僅有幾種，原核生物...