1樓:翦子美女
兩個目的:1熱激後的大腸桿菌細胞比較脆弱,培養可以恢復細胞的活性;2進一步培養,提高菌液中大腸桿菌的濃度。
為什麼大腸桿菌感受態細胞製備和轉化
2樓:元霜
轉化實驗用bai液態的lb是為了讓細du胞恢復培
zhi養,也有人稱
之為讓其孵育,質dao粒或其他經專在液態lb中恢復屬培養後再塗布平板(固態培養基),是為了分散開,以培養單克隆。一般經37度倒置培養12-16h後,就可以看到有單個克隆長出,就可挑取了。
大腸桿菌感受態細胞轉化實驗正負對照
3樓:唯愛
轉化a.將-70 0c下保bai存的感受態細胞(
du200μl),室溫下
zhi解凍後放置於冰上。dao
b.將nd-pucm-t質粒dna溶液(不超過50ng)或回pcr產物與pucm-t質粒的答連結產物,體積不超過10μl,輕輕搖勻,冰上放置30min。
c.42 0c水浴中熱擊90s或370c水浴中熱擊5min,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5min。
d.向管中加入預熱的1 ml lb液體培養基(不含ampr),混勻後370c下**培養1小時使細胞恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr)。
e.取上述菌液20-100l塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,等菌液完全乾後倒置平皿370c下培養16-24hr。
對照 1:以蒸餾水代替puc質粒dna,其它同上。
對照 2:以蒸餾水代替puc質粒dna,在步驟e 中,取5μl塗布於不含amp的篩選平板上。
計算:轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應總體積/塗布體積
轉化頻率= 轉化子總數/質粒dna量
感受態細胞總數=對照2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數
如何製備大腸桿菌感受態細胞
4樓:匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備:一. 材料
e. coli dh5α菌株: rˉ,mˉ,ampˉ;pbs質粒dna: 購買或實驗室自制,eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.lb固體和液體培養基
2.amp母液
3.含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60°C左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60°C左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l cacl2: 稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟:
一、 受體菌的培養
從lb平板上挑取新活化的e. coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37°C下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:
100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37°C振盪培養2-3小時至od600 =0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4°C下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4°C下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70°C可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70°C冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42°C水浴中熱擊90秒或37°C水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37°C振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37°C培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的lb平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下:
轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/塗板菌液體積
轉化頻率**化子數/每mg質粒dna)=轉化子總數/質粒dna加入量(mg)
感受態細胞總數=對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它e.coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。
有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
手上沾了感受態細胞液，感受態細胞的製備時有什麼注意事項
沒關係的，清洗乾淨就可以了，感受態細胞就是處理過的用來擴增dna的普通細胞，在手上也不會有什麼傷害，不用擔心 感受態細胞的製備時有什麼注意事項 1 培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有...
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pmd18t連一段多長的dna,連線dna用量及時間?轉化到哪個感受態細胞中?amp抗性平板長菌情況如何?仔專細觀察以上問題,屬考慮是否轉化不成功。培養基的體積是否小於試管體積的1 5?搖菌轉數是否達到250rpm,試管要斜放?是否觀察過菌體生長過程 2 6小時生長情況 是否有噬菌體汙染?如果轉化成...