1樓：
儲存：-70 ℃ 儲存，避免反覆凍融
2樓：諄蝗謝埔
方法一：細菌轉化的方法多以mendel和higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用於成批製備感受態細菌。
本法適用於大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重複性好。操作過程簡述如下。1．從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌dh52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到一個含有100mllb培養基的1l或500ml燒瓶中。
於37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量od600值≈0.4。2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。
3．於4℃用sorvallgs2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。4．倒數培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。5．以10ml用冰預冷的0.
1mmcacl2重懸每份沉澱，放於冰上。6．於4℃用sorvallgs3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以**細胞。7．倒出培養液，將管倒置1min以使最後殘留的痕量培養液流盡。
8．每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1mcacl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna或連線反應混合物（體積≤10μl，dna≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。
10．將離心管放到預加溫到40℃的迴圈水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。11．快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。12．每離心管加800μlsoc培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
13．將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/lmgso4和相應抗生素的sob培養基上。14．將平板置於室溫至液體被吸收。15．倒置平皿，於37℃培養，12～16h後可出現菌落。
方法二：cassuperone-step***petentcellprepskit採用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便於質粒dna的轉化，可滿足一般實驗的要求。與cacl2法相比具有多種優點：
使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的製備；轉化效率略高於cacl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞製成後即可儲存於-70℃,無須加入甘油，並且經長期儲存活力無明顯下降。準備工作：1．從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在lb平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。
挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5mllb培養基中，37℃，250rpm，過夜培養。2．次日從5mllb培養物吸取200μl轉入50mllb培養基中（250ml錐形瓶），37℃，250rpm培養2小時，此時od600約0.4—0.
5。感受態細胞的製備：3．吸取1ml菌液到1.
5ml離心管裡，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。4．加入100μl預冷的solutiona，懸浮菌體，冰浴30分鐘。5．此時感受態細胞已經制成可立即使用或-70℃儲存。
細胞轉化：6．在感受態細胞中加入100pg-10ngdna，混勻，冰浴30分鐘，然後42℃1分鐘熱擊，再次冰浴2分鐘。加入0.
9mllb培養基，20μlsolutionb，37℃，振盪培養1小時。7．取適當菌液（100-200μl）塗布相應抗性的平板。8．過夜培養約16個小時，數菌落數，計算轉化率。
補充說明：1．所用器具一定要清潔；2．操作步驟2中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高於此值：500ml錐形瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；3．在收穫菌體前半小時還可以在培養基中加入20mm的mgcl2，效果會更好一些；4．為保證細胞處於對數生長期，培養後的菌體的od值不要高於0.
6；5．製備感受態細胞時所有操作儘量保證在冰上操作；6．細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴後直接加入新鮮lb，簡化操作步驟，但轉化效率低於熱擊方法，適用於對轉化率要求不高的實驗。方法三：1、取1%大腸桿菌e.
coli接種於含2mllb培養基的試管中，37℃振盪培養過夜2、取0.1ml過夜培養物轉種於含10mllb培養基的三角瓶中，37℃振盪培養3h至od600=0.3ml離心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液5、把菌體懸浮於15m1冰冷的0.1mcacl2溶液中，置冰上30min6、然後再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液7、將菌體懸浮於0.1mlcacl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：（1）將1ml過夜培養的細菌（如dh52、tg1、tm101）接種於100ml2×yt培養於500ml燒瓶。於37℃刷烈振盪，通常≥200rpm培養的細菌密度約od550=0.
2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。（2）將培養物放於冰上致冷10min，於4℃離心細菌培養物，10000rpm離心10min。
（3）棄除上清，將細菌懸浮於原始培養體積的一半（約50ml）的50mmcacl2和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍液體中。（4）將細菌懸浮放在冰上約5min，然後將懸浮物於4℃10000/rpm離心10min。
（5）棄上清，懸浮細菌於原始培養體積的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl（ph8.0）無菌冷凍中。此時的細胞是感受態細胞，即可用於轉化。
200μl分裝於無菌的1.5ml微量離心管中，貯存於-80℃冰箱中。方法五：
tsb法（也是本人熱衷的方法）1.藥品製備1mmg2+(1mmgso4和1mmgcl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。
tsb液（30ml/80ml菌液）（現配現用）：peg33503gtryptone0.3gyeastextract0.
15gnacl0.3g2.步驟：
（1）活化菌株（2）挑單菌落培養於5ml的液笨培養基中（3）取液體培養物50ul於80ml的液體培養基中進行擴大培養（4）370c培養3－4小時，od600在0.4－0.6（5）離心，去上清（6）加入20mltsb，重懸（7）離心，去上清（8）加入10mltsb，再加入15－20%的甘油，分裝儲存注，整個操作過程均應在冰上進行。
所用藥品均需滅菌。轉化程式（1）取出200μl感受態細胞慢慢使其溶化，並立即放於冰上，加入dna或連線反應混合物，dna量通常≤50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然後放在冰上40～45min。
（2）將管放於42℃水浴中2min。（3）然後每管直接加入1.0ml2×yt培養基，倒置混勻，並於37℃培養8～12h，幹浴或水浴，不需振搖。
此期間使細菌生長並開始表達抗菌素。（4）每200μl轉化混合物分別於6個2×yt瓊脂培養板上補充相應抗生素，並含有x-gal（20mg/ml）、iptg（200mg/ml）。
感受態細胞製備完成速凍後存放負20可以嗎
3樓：匿名使用者
感受態細胞製備完成速凍後一般是負
80度或者液氮中凍存
如果不具備條件，負20度短時間儲存也可以。但是長時間儲存的話需要負80度或者液氮中儲存，並在培養液中加10%的dmso
所以感受態細胞製備完成速凍後暫時存放負20度是可以的，但是不能長期儲存
感受態細胞的製備時有什麼注意事項
4樓：天寂無痕
1、培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一
個非常理想方法。
2、在儲存感受態時，dmso 要比甘油的效果要好，它會使感受態的效率增加。
3、液氮速凍也會使感受態的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態，然後儲存於超低溫冰箱內。
4、凍存的感受態用一次拿一管，不要反覆凍融。化凍之後立即使用，不要冰上放太久。
5、操作時可以輕彈輕甩，儘量避免用移液器吹吸。
5樓：y神級第六人
（1）質粒dna的質量和濃度：
用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。
此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。
（2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃
（3）細胞的生長狀態和密度
最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。
（二）感受態細胞轉化中的影響：
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
手上沾了感受態細胞液，感受態細胞的製備時有什麼注意事項
沒關係的，清洗乾淨就可以了，感受態細胞就是處理過的用來擴增dna的普通細胞，在手上也不會有什麼傷害，不用擔心 感受態細胞的製備時有什麼注意事項 1 培養溫度。較低的溫度培養有利於感受態的形成，這樣可以獲得較高的感受態，但太低又不實用，因而產生了 inoue 的高效感受態製備方法，它實際是利用了所有有...
感受態轉化，什麼叫感受態細胞？什麼叫轉化
最近我bai們也在作感受態細胞轉du化 做轉化時zhi 一定要注意用冷的氯化鈣，dao還可以在加入回後42度熱休克90秒，這樣效答 果比較好。篩選時我們用的質粒中有氨卞黴素的抗性，所以只是在培養基中加入氨卞黴素就成了。但是藍白篩選不是白色的是轉入質粒的麼？籃斑是沒轉入的啊。www.biooo.com...
製作感受態細胞時寅要加抗生素嗎,製作感受態細胞時搖菌要加抗生素嗎
pmd18t連一段多長的dna,連線dna用量及時間?轉化到哪個感受態細胞中?amp抗性平板長菌情況如何?仔專細觀察以上問題,屬考慮是否轉化不成功。培養基的體積是否小於試管體積的1 5?搖菌轉數是否達到250rpm,試管要斜放?是否觀察過菌體生長過程 2 6小時生長情況 是否有噬菌體汙染?如果轉化成...