1樓：莫彷徨
選擇目的基因,並設計相應引物；
用引物pcr擴增目的基因片段；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入克隆載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution 1作用下與兩端各帶一個t的線性t載體直接相連）
將連線產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連線產物）,酶切鑑定和測序鑑定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連線,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
基因克隆的方法主要有哪幾種，簡述各種方法的原理和用途
2樓：匿名使用者
基因克隆
bai的方法主要有哪du幾種
選擇目的基因zhi,並設計相應引
物dao；版
用引物pcr擴增目的基因片段權；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入克隆載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution 1作用下與兩端各帶一個t的線性t載體直接相連）
將連線產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連線產物）,酶切鑑定和測序鑑定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連線,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
基因克隆有哪些步驟，如何篩選陽性克隆
3樓：匿名使用者
簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過pcr的方法。
pcr擴增的序列可以通過酶切或者topo ta的方法插入到載體質粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
目標基因克隆的主要方法有哪些
4樓：莫彷徨
基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（p.berg）等人於2023年把一種猿猴病毒的dna與λ噬菌體dna用同一種限制性內切酶切割後，再用dna連線酶把這兩種dna分子連線起來，於是產生了一種新的重組dna分子，從此產生了基因克隆技術。
2023年，科恩（s.cohen）等人把一段外源dn**段與質粒dna連線起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主複製能力的載體dna在體外人工連線，構建成新的重組dna，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組dna技術以及基因工程等。
採用重組dna技術，將不同**的dna分子在體外進行特異切割，重新連線，組裝成一個新的雜合dna分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。
基因克隆的方法有哪些
5樓：匿名使用者
簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過pcr的方法。
pcr擴增的序列可以通過酶切或者topo ta的方版法插入到載體質權粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
基因克隆的基本步驟有哪些
6樓：匿名使用者
選擇目的基因,並設計相應引物；用引物pcr擴增目的基因片段；選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將pcr片段連線入克隆載體中；（一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution1作用下與兩端各帶一個t的線性
基因克隆的步驟是什麼？
7樓：匿名使用者
不知道大家對基因克隆方面的技術瞭解多少，經過較長時間的總結和實踐，有了一些自己的體會，拿出來與大家分享一下，給大家做一個拋磚引玉的作用吧。
（1）是酶切位點的選擇.
我的實驗室有三種常用的酶,在設計pcr產物的酶切位點之前首先要看看哪兩個酶之間是可以進行同時酶切的.因為這三家公司的雙酶切表的組合完全不同,最佳的方案是我們能夠按照需要去選擇合適的酶.
（2）pcr引物的設計。
做過實驗的戰友都清楚,有的時候很多pcr引物的選擇是沒有選擇的,如果實在是沒辦法的條件下,只能在pcr引物的5端加入人為設計的鹼基而把引物的擴增部分後移或前移來避開難以擴增的部位,我不知道說清楚沒有,如果引物序列ok,可以忽略上句話.所以大多數情況下引物我們是沒得選擇的,那麼我們只能從pcr擴增條件上下功夫.
（3）pcr擴增
對於pcr擴增其實不同的基因可能策略不同.首先很多新手會忽略引物的濃度問題,把pcr的實驗條件進行了全方位優化,50ul體系中buffer 5ul、mg2+ 1mm、dntp 0.2mm、引物每支1ul（配成10umol/l濃度)、pcr酶一般是0.
5ul、其餘部分用水補平,混勻,離心一下,進行pcr擴增.其中引物從公司拿到乾粉後我一般用水溶解至100umol/l濃度儲存,吸取少量稀釋十倍後用於pcr反應,這個濃度是最佳的.所以pcr體系中引物並不是越多越好,同樣的模板的量也很關鍵,一般我都在10ng-100ng之間,太少或太多都會抑制pcr反應.
當然,不同的基因其退火溫度差異較大,建議第一次做直接做梯度pcr,設定的溫度範圍寬些,總會有擴出來的.反正把反應體系加好把溫度控制好,如果這樣仍然擴不出來,那就直接調整dna模版的量吧,其他的因素應該不是原因（當然得保證引物,以及酶的質量得前提下）.
（4）pcr產物的酶切,我認為pcr產物切得儘可能的充分對克隆很重要,畢竟保護性鹼基只有幾個.
（5）質粒的酶切.
雖然質粒的酶切很簡單但是卻很講究,決定著克隆的成敗.質粒提取我一般都用試劑盒,質粒提取完畢後我會用紫外分光光度法對質粒進行定量測定,根據a260的值計算出質粒的量,然後再進行酶切,一般酶切體系60ul,60ul體系中我只切總量1ug的質粒,一次切兩管,酶切過夜後切膠**或者不切膠直接**,這取決於兩個限制性內切酶之間的距離,十幾bp以內我就直接**了,如果偏大就要切膠**.
（6）連線
連線我採用的是promega公司的t4 dna連線酶,它的特點是22度連線三小時以上幾款,這樣我就可以在上午把質粒片段以及pcr片段**後馬上做連線,連線一個白天到下午可以做轉化了,塗板,過夜培養第二天早上看結果.然後挑克隆（一般我一個基因就挑四個克隆足已）培養一白天,下午稍晚些提質粒,然後馬上酶切鑑定,一般酶切鑑定體系中我都做20ul體系,酶用0.5微升就夠了（呵呵,該省的就省點吧）,酶切一個小時跑膠就可以知道克隆是否成功了.
這樣從pcr到克隆鑑定完畢,一共三天.
這個是個人在基因克隆
8樓：匿名使用者
dna的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的dn**段同能夠自我複製的載體dna連線，然後將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程
9樓：傾月聆寒
首先是目的dn**段的獲得，然後將目的片斷和載體分子連線，將匯入受體細胞，重組子的篩選，
從生物體克隆目的基因的方法有哪些？
10樓：中國農業出版社
1.pcr擴增克隆法
pcr擴增克隆法是在已知植物基因序列的基礎上，進行基因序列克隆的一種方法。先從基因文庫（genebank）中找到有關基因序列，據此合成一對寡聚核苷酸引物，從植物中提取染色體dna或rna，進行pcr擴增。擴增的片段純化後插入合適的質粒載體上，用酶切分析和序列分析檢測重組子，並與已知基因序列比較，以獲得目的基因。
2.功能克隆法
功能克隆（functionalcloning）是根據性狀的基本生化特徵，在鑑定已知基因功能後進行克隆。該法在純化相應的編碼蛋白質後，構建cdna文庫或基因組文庫。然後從文庫中用下述兩種方法進行基因篩選，其一是將純化的蛋白質進行氨基酸測序，據此合成寡核苷酸探針，從cdna文庫或基因組文庫中篩選編碼基因；其二是將編碼蛋白質製成相應抗體探針，從cdna載體表達文庫中篩選相應克隆。
實行功能克隆的關鍵步驟是分離出高純度蛋白質。對於產物不明的基因，不能利用這一方法進行克隆。
3.定位（圖位）克隆法
定位（圖位）克隆法（positionalcloning）根據目的基因在染色體上的位置，進而通過染色體步移（chromosomewalking）進行克隆。需預先建立具有目的基因的適宜遺傳分離群體（近等基因系或分離群體），將目的基因精確定位在染色體特定的位置之後，用目的基因兩側緊密連鎖的分子標記（rflp標記）為探針，篩選基因組文庫，得到陽性克隆，然後以陽性克隆的末端作為探針，獲得含有目標基因的大片段克隆，然後以這些新的dna為探針，獲得更趨近目的基因的dn**段，不斷縮小篩選區域，逐步向目的基因靠近，最終克隆到該基因。
4.轉座子標記法
轉座子（transposon）是可從一個基因位置轉移到另一位置的dn**段，而原來位置的dn**段**座子）並未消失，發生轉移的只是轉座子的拷貝。基因轉座可引起插入突變，使插入位置的基因失活，並誘導產生突變型。通過標記基因就可以檢測出突變基因的位置，進而克隆該突變基因。
這樣將轉座子作為基因定位的標記，並通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因稱為轉座子標記法（transposontagging）。para>5.減法雜交法
該法根據植物表現型差異或基因在不同組織或器官的表達差異來克隆植物基因。特異性表達的基因，其mrna表現不同。分別從表達特異性基因的植物組織和無特異性基因的組織中提取mrna，反轉錄為cdna，兩者雜交。
在兩種組織中都表達的基因產物形成雜交分子，而特異mrna轉錄的cdna仍保持單鏈狀態，將這種單鏈cdna分離出來即為差異表達的基因，這一策略被稱作減法雜。
6.mrna差異顯示法
該法可有效鑑別並克隆差異表達的基因。提取不同的mrna後可用共同的引物反轉錄成cdna，進行pcr擴增，獲得差異表達的cdna序列，作為探針，在cdna文庫或基因組文庫中篩選基因，並作功能分析。該法可直觀篩選差異表達的基因，比減法雜交操作方便、迅速，需要總rna量少，效率高，短期內可完成cdna的擴增、鑑定和克隆。
基因克隆和轉基因的步驟分別是什麼？有何區別？哪位大哥大姐幫忙解釋一下啊
基因克隆是把 一個基復因通過制pcr複製出來，連線到載體上，再轉入大腸桿菌表達相應的蛋白。轉基因是把某個基因連到相關的載體上 或者同源臂上 然後注入目標動物或者細胞，通過重組，使目標動物或者細胞帶有這個基因，就是把基因轉到了動物或者細胞上。步驟太多了，給你說不清楚。想知道相關的東西，可以找相關的書看...
耐熱菌的基因克隆，耐熱菌的基因克隆
基因克隆 bai的方法主要有哪du幾種 選擇目的基因zhi,並設計相應引 物dao 版 用引物pcr擴增目的基因片段權 選擇合適 抗性標記 酶切位點等 的克隆載體 為了保真擴增 並將pcr片段連線入克隆載體中 一般用taq酶的pcr產物在末尾會自帶一個a,可在solution 1作用下與兩端各帶一個...
基因敲除的操作步驟
基因敲除的操作bai步驟基本du是獲得幹細胞 載體構建 zhi 匯入dao基因 性狀改變。內 利用基復因打靶 技術產生轉基因動制物的程式一般為bai 將基du因打靶載體通過一zhi定的方式 常用電 dao穿孔法 匯入同源的胚胎幹細胞 escell 中，使外源dna與胚胎幹細胞基因組中相應部分發生同源...