1樓：人設不能崩無限
1、鹽析法：
鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。
2、有機溶劑沉澱法：
有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其
一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其
二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。
3、蛋白質沉澱劑：
蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇沉澱作用：
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。
2樓：簡單de回憶
主要有四種方法：
1、根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。
透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。
它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果。
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離。
使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的範圍選擇合適的密度梯度。
密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。
凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑑定證明產品為分子量約為32 kda、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白。
凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質。
2、根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的ph值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和ph值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。
等電點沉澱和ph值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質在一定ph值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的ph值來分離純化蛋白質。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如mgcl2、(nh4)2so4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如nacl、nh4cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:
以10%nacl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調ph值至中性。
為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽。
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、ph值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。
由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止區域性濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。
冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由cohn於2023年提出,用於製備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前who規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(aqueous two phase extraction,atpe)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。
對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分佈在上相併得到濃縮,細胞碎片等固體物分佈在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液ph值、離子強度、鹽型別及濃度的影響。
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種奈米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。
程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。
3、根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是裝置簡單、操作方便、樣品用量少。
等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有ph梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的ph值梯度處形成一個窄條帶。
有研究聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。
離子交換層析(ion exchange chromatography,iec)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。
離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的ph值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。
反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的ph值洗脫下來。
4、利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從複雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須瞭解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。
近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛。
在實際工作中,很難用單一方法實現蛋白質的分離純化,往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質。
3樓：無弦的
蛋白質分離提純的一般原則
1. 前處理
把蛋白質從原
來的組織或溶解狀態釋放出來，保持原來的天然狀態，並不丟
失生物活性。常用的方法：勻漿器破碎、超生波破碎、纖維素酶處理以及溶菌酶等。
超聲波破碎法：當聲波達到一定頻率時，使液體產生空穴效應使細胞破碎的技術。超聲波引起的快速振動使液體區域性產生低氣壓，這個低氣壓使液體轉化為氣體
，即形成很多小氣泡。由於區域性壓力的轉換，壓力重新升高，氣泡崩潰。崩潰的氣泡產生一個振動波並傳送到液體中，形成剪下力使細胞破碎。
2． 粗分級
分離可用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，
3． 細分級
樣品的進一步純化。樣品經粗分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。
必要時還可選擇電泳、等電聚焦等作為最後的純化步驟。
結晶是最後的一步
分離純化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.電荷；4.吸附性質；5.對配體分子的生物親和力等。
(一)根據分子大小不同的純化方法
1. 透析
利用蛋白質分子不能通過半透膜，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽、單糖等分開。
2. 密度梯度離心。
蛋白質顆粒的沉降係數不僅決定於它的大小，而且也取決於它的密度。
3. 凝膠過濾
利用蛋白質分子大小，因為凝膠過濾所用的介質是凝膠珠，其內部是多孔的網狀結構。當不同的分子大小的蛋白質分子流過凝膠層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子進入珠內的網狀結構，而被排阻在凝膠珠之外隨溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動並最先流出柱外，比網孔小的分子能不同程度底自由出入凝膠珠的內外，由於不同大小的分子所經路徑不同而得到分離。大分子先被洗脫下來。
小分子後被洗脫
(二)利用溶解度差別的純化方法
1．等電點沉澱和ph的控制
蛋白質處於等電點時，其淨電荷為零，由於相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而聚集沉澱。因此在其他條件相同時，它的溶解度達到最底點，利用等電點分離蛋白質是一種常用的方法。
2. 蛋白質的鹽溶和鹽析
中性鹽可以增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶。鹽溶作用是由於蛋白質分子吸附某種鹽類離子後，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而蛋白質分子與水相互作用加強了，因而溶解度增加
當溶液的離子強度增加到一定數值時，蛋白質的溶解度開始下降。當離子強度足夠高時，很多蛋白質可以從水溶液中沉澱出來，這種現象稱為鹽析。
鹽析作用的主要原因是大量中性鹽的加入使水的活性降低，原來溶液的大部分甚至全部的自由基水轉變成鹽離子的水化水
蛋白質電泳問題蛋白質電泳問題
我做過g 25柱，效果不錯。我所在小組也用過磷酸緩衝液做純化，也用透析除鹽，同樣也遇到過和你一樣的問題，洗脫峰明明有光吸收，可是就是跑膠沒帶，現在這個問題已經解決，呵呵，很有可能你跟我們的問題一樣。問題關鍵是 蛋白濃度！我們的蛋白本身易降解，且純化率低，蛋白濃度很低，再加上透析 除鹽等複雜步驟，脆弱...
怎麼補充蛋白質，怎樣補充蛋白質？
堅果和種子是植物的精華部分，一般都營養豐富，含蛋白質 油脂 礦物質，維生素較高，對人體生長髮育 增強體質，預防疾病有極好的功效。牛奶是最古老的天然飲料之一，被譽為 白色血液 對人體的重要性可想而知，主要成份有水 蛋白質 無機鹽等。優質蛋白質如何補充？春天是寶寶快速生長的季節，寶寶身體發育快，所需要的...
蛋白質粉好嗎，蛋白質粉好嗎
乳清蛋白是從牛奶乳清中分離提出的，具有純度高 吸收率高的特點。大豆蛋白是源於大豆的一種植物蛋白，除了構成生物有機體以外，其含有的免疫球蛋白 抗體都具有維持機體免疫功能的作用，且植物蛋白還可以有效地保障人體正常的生理需求。這位朋友我想你問的是吃了之後會有什麼樣的反映吧？蛋白粉當然可以吃 但是個人認為對...